抗日同盟军被迫撤销后，宋哲元回察主政。佟麟阁深感抗日之志未遂，而山河破碎，国运垂危，不胜悲愤，于是退居北平香山寓所，与家人团聚，奉养双亲。寄情于研读圣经、周易，写字、摄影、打猎，以待报国时机。

在隐退期间，宋哲元再三敦请佟麟阁出山，负责军事。第二十九军的师长冯治安、赵登禹、张自忠、刘汝明等亦联袂相邀。此时天津大学生和人民群众的抗日救亡运动，日益激昂。佟麟阁感到抗日救国之日到来，于是欣然出山。回任第二十九军副军长兼军事训练团团长(教育长为张寿龄)，还兼大学生军训班主任，住南苑二十九军军部，主持全军事务。整军经武，夙夜匪懈。他曾对人说“中央如下令抗日，麟阁若不身先土卒行，君等可执往天安门前，挖我两眼，割我两耳”。声情激越，闻者热血沸腾。

全国有志抗日救国青年，慕将军坚决抗日的声誉，或跋涉千里，或从海外归来，有的就是抗日同盟军的干部和共产党员，都来参加第二十九军，入军事训练团受训。宋哲元负责维持冀察政局，被外敌内奸威胁引诱，进退两难，穷于应付，便借为父亲修墓和养病为名，干1937年2月底离干，而以佟麟阁代理军长职务，直接负军事指挥之责。佟麟阁身负二十九军指挥重任，乃时时以国家处境之危，二十九军责任之重，教育官兵，使明战伐，他还随时将敌我情况报告中央和冯玉祥(这时冯玉祥在南京任军事委员会副委员长)，使上下无所隔离。他与冯治安、赵登禹、张自忠、刘汝明诸师长精诚团结，以共同御敌，二十九军将士之所以拼命赴敌，多得力于佟麟阁的明耻教战。

1937年7月6日，日军驻丰台的清水节郎中队，全副武装，要求通过宛平县城到长辛店地区演习。宛平第三十七师驻军不许，相持达十余小时。二十九军当即作了应变准备，严阵以待。至晚，敌始退去。7日夜间，日军一个中队突然向芦沟桥守军发起攻击。佟麟阁代军长立即命令三十七师一一○旅旅长何基沣自卫还击。该旅吉星文团金振中营遂奋起抵抗。卢沟桥的枪声，响彻了大地，全民族的八年神圣抗战，从此开始。

七七事变爆发后，佟麟阁以副军长之职负责军事指挥，以军部名义向全军官司兵发出命令：凡是日军进犯，坚决抵抗，誓与卢沟桥共存亡，不得后退一步。时人在《北平时报》赞佟麟阁说：“佟副军长善治军，第二十九军纪律严明，勇于作战，而于老百姓秋毫不犯，佟将军训练之力也。”“军士于烈日守城，各队前置水一桶，用开水以止渴，商民感激欲泣，敬献西瓜，坚决不受，对老百姓恭而有礼，杀敌则勇猛武伦，堪称模范军人”。

1937年7月28日，日军向北平发动总攻击，进犯南苑，时任第29军副军长的佟麟阁与132师师长赵登禹指挥29军死守南苑，佟麟阁被机枪射中腿部，部下劝其退下，他执意不肯，仍带伤率部激战。与日军从拂晓战至中午，头部又再受重伤，终因流血过多壮烈殉国，时年45岁。