伊苏9的主要剧情是男主角亚特鲁在7代故事完结后前往监狱都市继续冒险，结果却被罗蒙帝国的星刻骑士团刁难并囚禁在监狱中，此后又卷入当地的特殊异界型灾难，怪人之夜。为了解决怪人之夜，亚特鲁和各位怪人成为伙伴，一步步相遇相知，从隔着怪人化的皮到互相理解互相帮助，暂时成功的解决了怪人之夜的阶段性爆发。

在此过程中，会时常出现一个在狱中的亚特鲁和在外界行动的亚特鲁彼此切换的情况，同时星刻骑士团也变得更加奇怪，甚至出现了副团长被架空要秘密处死的情况，这些奇怪现象都为后续的剧情埋下了巨大伏笔。

故事推进到主线七八章，剧情开始暴走，星刻骑士团的行为之所以如此怪异是因为罗蒙帝国被蒙骗，为了这次的计划幕后黑手左拉早已安排自己制作的炼金人造人进行大规模渗透，甚至连玩家操控的在监狱外的亚特鲁都是人造人（每当玩家操控人造亚特鲁的时候就是真亚特鲁在狱中入睡的时期，反之则是人造入睡）。

女主角阿普莉莉丝被背刺，众人失忆，就在这个时候真亚特鲁杀出回归，同时阿普莉莉丝诈尸，解释了整件事情的来龙去脉。一切源于该地区五百年前的诅咒怪人之夜，现在的主角团众人所持有的怪人化样貌，是当年与阿普莉莉丝以及黑幕左拉一起对抗怪人之夜的六英雄的形象。但是，两人都没能成功对抗怪人之夜，而这也导致了女主角和左拉走上了截然相反的两条路。

左拉的最终目的是试图借助亚特鲁的记忆和经验（亚特鲁在冒险中遇到过很多神明和古代怪物），结合怪人之夜魔力最强盛的时间，炼成足以终结怪人之夜的人造神明。左拉也的确成功了，他成功的造出一个拥有男主角亚特鲁相貌和记忆的人造神明，但是人造神并没有认同左拉关于阻止怪人之夜的想法，他认为只有让整个监狱都市地区消失才能完全阻止怪人之夜，于是他想要杀死在场的所有人后毁灭整个地区。

不过在男主角和众多伙伴的帮助下，人造神明被击败，但是怪人之夜并没有被解决，于是众人借助左拉的技术，根据亚特鲁的记忆制造出了亚特鲁冒险途中曾经遇到过的一系列神明（都是系列游戏前作出现过的人物），并且在她们的帮助下成功打爆了怪人之夜的概念核心，完美解决了此次事件。

最后男主角和各个伙伴告别并踏上了新的冒险旅途。